Otka-46243 kutatási zárójelentés

Az OTKÁ-hoz 2003.-ban "A prekondicionálás korai és késői antiarrhythmiás hatásában
szerepet játszó mechanizmusok farmakológiai és molekuláris vizsgálata" címmel benyújtott
pályázatban vázolt kutatási tervezet végrehajtása során a következő eredményeket értük el
A prekondicionálás kardioprotektív hatásában szerepet játszó mechanizmusok vizsgálatasorán 1992.-ben elsőként vetettük fel a nitrogén monoxid (NO) szerepét a prekondicionáláskardioprotektív hatásában. Kimutattuk, hogy a NO mint trigger és mint mediátor is részt vesza prekondicionálással, az ischaemia és reperfúzió (I/R) során fellépő súlyos kamraiarrhythmiákkal szemben, kialakítható korai és késői védőhatásban. Vizsgálatainkban, altatottkutyákban, prekondicionáló ingerként rövid ideig tartó koszorúér okklúziókat, a jobb kamránkeresztül magas frekvenciájú szívingerlést vagy futószalagon fokozatosan erősődő fizikálisterhelést okklúziót/reperfúziót (teszt ischaemia) megelőzően. A 2003 és 2007 között eltelt 4 éveskutatási periódusban a NO trigger és mediátor szerepét vizsgáltuk a fizikális terhelésselvégzett prekondicionálás késői kardioprotektív hatásában. Kísérleteinkben a szelektív ésspecifikus iNOS gátló etil-metil-isothioureát (AEST), valamint a specifikus de nem szelektívnitrogén oxid szintáz (NOS) enzimet gátló L-NAME-t használtuk. Kimutattuk, hogy mind afizikális terhelés előtt alkalmazott L-NAME, mind a terhelést követően, de az okklúzió előttadott AEST csökkentette a fizikális terhelés antiarrhythmiás hatását, amely arra utal, hogy aNO triggerként és mediátorként is részt vesz a prekondicionálás késői antiarrhythmiáshatásának kialakításában. Eredményeinket 2003.-ban hazai és külföldi kongresszusokonismertettük és 2005.-ben a Life Science-ben közöltük (1). A NO késői antiarrhythmiáshatásban játszott szerepét igazolták azok a kísérleteink is, amelyekben kimutattuk, hogy a peros alkalmazott PDE gátló sildenafil (Viagra), csökkenti a 24 óra múlva előidézett ischaemiaés reperfúzió során megjelenő arrhythmiákat. Eredményeinket kongresszusi előadásbanismertettük és a British Journal of Pharmacology-ban "Rapid Communication"-ként közöltük(2).
Ugyancsak elsőként mutattuk ki, hogy a prekondicionálás antiarrhythmiás hatásában szerepetjátszanak a vazodilátor hatású prosztanoidok (Végh és mtsi., 1990). Jelen kísérleteinkben aprosztaciklin részvételét tanulmányoztuk a fizikális terheléssel kialakítható prekondicionáláskésői antiarrhythmiás hatásában. Kimutattuk, hogy a ciklooxigenáz enzimgátló celecoxib afuttatás késői antiarrhythmiás hatását számottevően nem befolyásolja. Eredményeinket 2004.-ben a European Journal of Pharmacology-ban publikáltuk (3). A különböző ingerekkel(koszorúér okklúzió, szívingerlés, fizikális terhelés) kiváltható prekondicionálás korai és későiantiarrhythmiás hatásáról, 2005. februárjában, a törökországi Antalyában megrendezettNATO Advanced Research Workshop-on, felkért előadásban számoltunk be, amelynekanyagát a Journal of Experimental and Clinical Cardiology közlemény formájában publikálta(4).
Számos irodalmi adat igazolja, hogy a reaktív oxigén gyökök (ROS) szerepet játszanak aprekondicionálás korai és késői ischaemiás károsodást, valamint a reperfúziót követőkontraktilitási diszfunkciót (miokardiális stunning) csökkentő hatásában. Ezzel szembenkevés, zömében ellentmondásos adat áll rendelkezésünkre a ROS-nak a prekondicionálásantiarrhythmiás hatásában betöltött szerepére vonatkozóan. Ezért, altatott kutyákon végzettokklúziós/reperfúziós modellünkben, vizsgáltuk a ROS szerepét a prekondicionálás koraiantiarrhythmiás hatásában. Kimutattuk, hogy rövid koszorúér okklúziókkal prekondicionáltszívekben, a prekondicionáló okklúziók felengedését követően chemiluminescenciávaldetektálható szabadgyök képződés észlelhető, amelyet a gyökfogó merkaptopropionilglicin(MPG) közömbösíteni képes. Ennek ellenére az MPG a prekondicionálás antiarrhythmiás hatását számottevően nem befolyásolta. Mindezek alapján arra következtettünk, hogy "invivo" körülmények között a reaktiv szabadgyökök nem elengedhetetlenül szükségesek aprekondicionálás antiarrhythmiás hatásának kialakításához. Eredményeinket kongresszusielőadásban, illetve a közlemény formájában ismertettük (5) A NO és a ROS a prekondicionálás antiarrhythmiás hatásában játszott szerepénektanulmányozását célozták azok a legújabb kísérleteink is, amelyekben a két erősen reaktívszabadgyök reakciójából képződő peoxinitrit hatását vizsgáltuk az I/R során fellépőarrhythmiákra. Kimutattuk, hogy a kis koncentrációban (100 nM) közvetlenül a koszorúérkeringésbe infúzió formájában bejuttatott peroxinitrit, a prekondicionáláshoz hasonló módon,csökkentette az okklúzió és reperfúzió soán fellépő kamrai arrhythmiák súlyosságát. Ezekbena kísérletekben meghatároztuk a peroxinitrit képződésre utaló nitrotirozin mennyiségétWestern-blot módszerrel. Eredményeink azt mutatták, hogy mint a rövid (2 x 5 perc)koszorúér okklúziókkal végzett prekondicionálás, mind a peroxinitrit hasonló időtartamúintracoronariás infúziója, szignifikánsan csökkentette a hosszú (25 perc) okklúziós/reperfúziósinzultus eredményeinket hazai (6) és nemzetközi (7, 8) kongresszusokon ismertettük, és aközeljövőben publikálni fogjuk.
Az elmúlt négy évben kutatómunkánk másik nagyobb témakörét a gap junkciós csatornáknakaz arrhythmogenezisben játszott szerepének vizsgálata jelentette. Irodalmi adatok utaltak arra,hogy a gap junkciós csatornák funkciójának megváltozása (nyitott/zárt állapot) jelentősmértékben hozzájárulhat a különböző kardiovaszkuláris kórképek kialakulásához. 2005.-benvizsgálatokat kezdtünk annak a megállapítására, hogy a gap junkciós csatornák milyenmértékben vesznek részt az ischaemia/reperfúzió során fellépő kamrai arrhythmiákkeletkezésében. Tanulmányoztuk azt is, hogy vajon a prekondicionálás (PC) módosítja-e agap junkciós csatornák működését, és amennyiben igen, akkor ez összefüggésbe hozható-e aprekondicionálás antiarrhythmiás hatásával. Eredményeink arra utalnak, hogy a szívizom gapjunkciós csatornáinak az ischaemia elötti szétkapcsolása (zárása) a specifikus, csak a gapjunkcionális csatornákon ható carbenoxolonnal (CBX), hasonló antiarrhythmiás hatást idézelő, mint a rövid koszorúér okklúziókkal végzett prekondicionálás. Ezzel szemben, ha aprekondicionálást carbenoxolon jelenlétében végeztük, az ischaemia során az arrhythmiákszáma és súlyossága fokozódott, azaz az önmagukban antiarrhythmiás hatású ingerek együttalkalmazása gyengítette, illetve megszüntette a protektív hatást. A mechanizmus felderítéseérdekében az in vivo kísérletekben mértük a szöveti impedancia változását, amely a gapjunkciós csatornák elektromos vezetőképességében bekövetkező változásokról szolgáltatinformációt. Továbbá az ischaemiás periódus végén vett szöveti mintákban meghatároztuk agap junkciós csatornákat felépitő speciális fehérje, a connexin43 (Cx43) foszforilációsmintázatában bekövetkező változásokat Western blottal, valamint a szöveti permeabilitás(metabolikus kapcsolat) változását "kettős festéses" módszerrel. Mind az "in vivo"kísérletekben mért impedancia változások, mind az "in vitro" módszerekkel végzettvizsgálatok eredményei arra utaltak, hogy a kontroll állatokban mérhető, különösen az Ibfázisú arrhythmiák megjelenését közvetlenül megelőző erőteljes rezisztenciaemelkedés (gapjumkció záródás) a prekondicionált, illetve a carbenoxolonnal kezelt állatokban elmaradt,illetve mérséklődött, míg a CBX + PC állatokban hasonló volt, mint a kezeletlen kontrollban.
Hasonlóképpen a PC és a CBX-szel külön-külön kezelt állatokban a CX43 foszforiláltformája (gap junkció nyitott állapotát jellemzi) és a szöveti permeabilitás megőrződöttszemben a kontroll és a PC + CBX együttes adását követően, ahol a csatornák fokozottzáródása következtében a permeabilitás csökkent és a Cx43 defoszforilált formája nagyobbmennyiségben fordult elő. Mindezek alapján arra következtettünk, hogy a gap junkciós csatornák részleges zárása, történjen ez akár rövid prekondicionáló okklúzióval vagy acarbenoxolonnal, olyan folyamatokat indít el, amelyek a hoszú ischaemiás periódus alattgátolják a csatornák további szétkapcsolását, csökkentik az ischaemiás területen belül azelektromos inhomogenitás mértékét és, ezáltal az arrhythmiák kialakulását. Ugyanakkor, ha aprekondicionálást carbenoxolon jelenlétében végezzük, azaz a gap junkcionális csatornákszétkapcsolása erőteljesebb az ischaemiát megelőzően, az arrhythmiákkal szembeni védőhatásmegszűnik, feltehetően azáltal, hogy a prekondicionálás során képződő, és a védőhatáskialakításához szükséges "trigger" vagy "mediátor" molekulák sejtek közötti transzportjagátlódik. Ezeket az eredményeinket számos hazai és nemzetközi kongreszuson ismertettük és2007.-ben a Cardiovacular Researchben közöltük (9). Melepő eredményeket kaptunk azonvizsgálataink során, amikor a carbenoxolont közvetlenül az ischaemia előtt kezdtük adni és akoszorúér okklúzió teljes időtartama alatt fenntartottuk. Ebben az esetben is a carbenoxolonantiarrhythmiás hatásúnak bizonyult, és ez arra utal, hogy a gap junkciós csatornák ischaemiaelötti zárása meghatározó mechanizmus a védőhatás kiakalításában, és ezt a hatást a szerokklúzió alatti alkalmazása már nem befolyásolja. Ezekből az eredményeinkből készültközleményt a Cardiologia Hungarica közlésre elfogadta (10).
Kevésbé sikeresek voltak azok a kollaborációban végzett vizsgálataink, amelyek aprekondicionálás hatására genetikai szinten bekövetkező változások vizsgálatát célozta.
Ezekben a kísérletekben, prekondicionáló ingerként magas frekvenciájú szívingerléstvégeztünk, majd 24 óra múlva a koszorúér elzárásával ischaemiát idéztünk elő. A kísérletvégén vett szövtmintákból gén-chip technikával vizsgáltuk a prekondicionálás hatásárakialakuló eltéréseket, az ép, illetve az ischaemiás szívmintákhoz képest. Az ép szívekhezképest a közel 2000 vizsgált génből kb. 40 gén mutatott eltérést ischaemia hatására, ésezekből kb. 16 gén változott prekondicionálás után. Az eredmények igazolására kvantitatív-PCR vizsgálatok is történtek, amelyek nem minden esetben igazolták vissza a chiperedményeket. Az adatok értékelése és értelmezése jelenleg is folyik.
laboratóriumunkban a hűtőszekrény zárlata miatt tűz keletkezett, aminek következtében amunkacsoport három laboratóriuma, a benne lévő nagyértékű műszerekkel együtt, közel 40millió forintértékben károsodott. Az in vivo és a molekuláris vizsgálatainkhoz használtvegyszereink szinte teljes mértékben (kb. 5 millió forint) megsemmisültek. A károk rendezésetöbb mint fél évet vett igénybe, így csak 2007. elején tudtuk a kísérleteinket tovább folytatni.
Mindezen nehézségek ellenére, a munkacsoport diplomás és szakdolgozó tagjainak áldozatosmunkájának köszönhetően, a kutatásainkat sikeresen végeztük, amelyet kongresszusirészvételeink illetve közleményeink is jeleznek. Kutatómunkánk sikeres teljesítéséhezköszönjük az OTKA támogatását.

Source: http://real.mtak.hu/1354/1/46243_ZJ1.pdf